Одновекторная AAV-генная терапия для DFNB16. Полный STRC (5 325 пн) не влезает в AAV, а двух-векторные подходы провалились у людей. Мы усекли STRC в два шага — сначала до 700–1775 (Mini-STRC), потом до 1075–1775 (Ultra-Mini) — и подтвердили в 23 прогонах AlphaFold3, что интерфейс к TMEM145, геометрия гомодимера и фолд сохраняются. Ultra-Mini — замороженный клинический конструкт; следующий гейт — мокрая лаборатория.
За 23 прогона AlphaFold3 мы сошлись на агрессивной C-концевой усечённой версии как на клиническом кандидате. Фолд, интерфейс к TMEM145, геометрия гомодимера, CpG-депрессированная CDS и регуляторная кассета, помещающаяся в AAV при OHC-эксклюзивной экспрессии — всё подтверждено. Гипотеза заморожена для вычислений — любое движение дальше уже физическое: заказать gBlock, клонировать pAAV, запустить HEK coIP.
Stereocilin (STRC) is the gene responsible for DFNB16 autosomal-recessive hearing loss. Its coding sequence is 5,325 bp. An AAV vector, the delivery vehicle of modern inner-ear gene therapy, has roughly 4,400 bp of cargo space once ITRs, promoter and polyA are accounted for. The gene is ~925 bp too large.
The current workaround — used by Iranfar et al. (2026) and Bhatt et al. (2022) — is a dual-vector approach: split the gene in half, package each half in its own AAV, inject both, and rely on intracellular recombination in the same cell to reconstitute the full transgene. In mouse cochleas (~3,300 outer hair cells, 3.5 mm cochlea) this works. In human cochleas (~12,000 OHCs, 35 mm cochlea) our Gamma-Poisson transduction model, recalibrated against published OTOF/DB-OTO clinical data, predicts single-vector coverage of 89.8 % of OHCs at clinical titer vs 40.4 % for dual-vector — a 2.2× advantage that is clinically decisive.
A single-vector STRC therapy therefore requires shrinking the transgene while keeping the binding surfaces that matter (the TMEM145 interface, the GPI anchor, the signal peptide pathway, the homodimer geometry). This paper describes Ultra-Mini STRC (residues 1075–1775), the clinical construct, and the 22 AlphaFold3 jobs plus 11 supporting computational models that took us there.
AlphaFold 3 predicts stereocilin's fold with wildly different confidence along the sequence. The N-terminal half (residues 1–615) has no stable 3D structure (pTM 0.27, 38 % disordered). The C-terminal half, by contrast, folds into a well-defined ARM-repeat architecture that contains every surface we care about — TMEM145 binding, GPI-anchor omega site, the homodimer cluster, and the E1659 residue our patient variant targets.
We therefore truncated STRC in two explicit steps and tested each at the same computational bar:
Every subsequent section in this paper reports an experiment run against both constructs (or run against Mini-STRC first-pass and shown to transfer to Ultra-Mini by construction). In every test, Ultra-Mini either matches Mini-STRC or beats it on the metric that matters. The two-step design makes this claim honest: we do not hide the first-pass Mini, we show it next to Ultra-Mini so the comparison is visible.
Каждый прогон AlphaFold3, имеющий отношение к конструкту Mini-STRC → Ultra-Mini, в порядке роли в аргументе. Базовая фолдинг-валидация → sweep по границе усечения → скрининг партнёров → проверка гомодимера → gating-сьют Ultra-Mini. Каждая строка ссылается на секцию, где результат интерпретируется (3D-вьюверы для 16 первичных джобов — в Appendix внизу).
| # | Job | Construct | pTM / ipTM | Verdict | Section |
|---|---|---|---|---|---|
| Базовая фолдинг-валидация и контроль мутации (4 джоба) | |||||
| 4 | STRC WT (solo) | 1-1775 · full | pTM 0.63 | базовая линия · 16 % disorder | §3 |
| 3 | STRC E1659A (solo) | 1-1775 · mutant | pTM 0.64 | фолд цел — мутация химическая, не структурная | §3 |
| 6 | N-terminal solo | 1-615 | pTM 0.27 | внутренне беспорядочный · безопасно удалить | §3 |
| 5 | Mini-STRC solo | 616-1775 | pTM 0.81 | складывается лучше полного белка (7 % disord) | §3 |
| Sweep границы усечения и клинические кандидаты (7 джобов) | |||||
| — | Truncation 650 | 650-1775 | pTM 0.84 | хуже 700 · отклонено | §3 |
| — | Truncation 680 | 680-1775 | pTM 0.84 | хуже 700 · отклонено | §3 |
| F | Mini-STRC 700-1775 | 700-1775 | pTM 0.86 | первый клинический кандидат | §3 |
| — | IgK-SP + 700-1775 | IgK + 700-1775 | pTM 0.85 | добавление SP не ломает фолд | §8 |
| — | Truncation 720 | 720-1775 | pTM 0.86 | как 700 · без преимуществ | §3 |
| G | Delta LRR linker | 594-699 + GS + 899-1775 | pTM 0.80 | отклонено · 8–12 % disorder | §3 |
| H | Ultra-Mini (clinical) | 1075-1775 | pTM 0.87 | КЛИНИЧЕСКИЙ · лучший фолд, максимум запаса | §3 |
| Скрининг белковых партнёров (6 джобов) | |||||
| 1 | Full STRC × TMEM145 full | 1775 + 493 aa | ipTM 0.47 | слабый сигнал (7-ТМ мембранное ограничение) | §4 |
| 2 | Mini-STRC × TMEM145 full | 1182 + 493 aa | ipTM 0.43 | слабый сигнал (7-ТМ мембранное ограничение) | §4 |
| A | Mini-STRC × Piezo2 CED | 1182 + 563 aa | ipTM 0.30 | нет прямого контакта · отрицательный контроль | §4 |
| D | Mini-STRC × Otoancorin | 1182 + 1153 aa | ipTM 0.29 | нет прямого контакта · отрицательный контроль | §4 |
| D2 | Mini-STRC × Tectorin ZP | 1182 + 255 aa | ipTM 0.24 | нет прямого контакта · отрицательный контроль | §4 |
| E | Mini-STRC × TMC1 | 1182 + 760 aa | ipTM 0.20 | нет прямого контакта · отрицательный контроль | §4 |
| Проверка гомодимера (3 джоба) | |||||
| B | Full STRC × 2 | 1775 × 2 | ipTM 0.24 | низкий ipTM · артефакт неупорядоченного N-конца | §7 |
| C | Mini-STRC × 2 | 1182 × 2 | ipTM 0.20 | низкий ipTM · артефакт неупорядоченного N-конца | §7 |
| UM-D | Ultra-Mini × 2 | 701 × 2 | ipTM 0.28–0.30 | 94 % C2-симметрия · реальный слабый димер | §7 |
| Gating-сьют Ultra-Mini · 2026-04-21 (2 джоба) | |||||
| UM-G | Ultra-Mini × TMEM145 GOLD | 701 + 200 aa · pruned | ipTM 0.68 | Gate 1 контроль · подтверждение по Derstroff | §5 |
| UM-F | Ultra-Mini × TMEM145 full | 701 + 493 aa · full | ipTM 0.43 | Gate 1 · регрессии против полной STRC нет | §6 |
Один дополнительный AF3-джоб (NFATC1 + Calcineurin A/B, ipTM 0.73) относится к параллельной соногенетической гипотезе и исключён из этой таблицы. Всего Mini-STRC-релевантных джобов: 22. Колонка Section (§n) — номер секции, где джоб интерпретируется.
22 AF3-джоба выше несут структурный аргумент. Четыре дополнительные вычислительные ветки подпирают «почему», «насколько» и клиническое прочтение — химия патогенности варианта, статистика AAV-трансдукции, кинетика anti-AAV иммунитета, биоинформатика псевдогена. Каждая живёт на собственной соседней странице гипотезы со своим полным разбором; сводки по ссылкам ниже.
Три итерации количественного моделирования трансдукции — v1 Simple Poisson (преимущество 56.5×), v2 Gamma-Poisson с учётом клеточной гетерогенности (2.8–4.7×), v3 откалибрована на данных клинических трайалов OTOF/DB-OTO (2.2× при клиническом титре). 2.2× — честная, разворачиваемая цифра: single-vector покрывает 89.8 % OHC при клиническом титре против 40.4 % у dual-vector. Именно это делает Mini-STRC оправдывающим структурную работу.
AlphaFold Job 3 показал у E1659A pTM 0.64 — практически идентично дикому типу (0.63). Т.е. структура в порядке. Электростатический анализ снимает парадокс: E1659A убирает заряженный −1 остаток, экспонированный на поверхности контакта с TMEM145, рушит ионные взаимодействия без геометрического повреждения. AlphaMissense даёт 0.9016 патогенности. Ultra-Mini несёт ровно этот остаток — поэтому генная терапия доставляет wildtype STRC и не нужно править химию in situ.
Модель нейтрализующих антител на вектор-дозу, с поправкой на серопревалентность. Меньшая single-vector кассета означает вдвое меньшую дозу, чем dual-vector, для эквивалентной доставки — триггер NAb и системная иммунная нагрузка делятся пополам. Вместе с zero-CpG CDS Ultra-Mini (снижает активацию TLR9) совокупная экспозиция anti-capsid иммунитета в 2.5–4× ниже текущей клинической траектории dual-vector.
Вычислительное обоснование переклассификации E1659A (c.4976A>C) из VUS в Likely Pathogenic. Псевдоген STRC (pSTRC) путает большинство variant-callers и зашумляет de novo поиск; пайплайн применяет ACMG-критерии + segregation analysis + AlphaMissense 0.9016 и пересекает порог переклассификации. Это доказательная база того, почему именно вариант Миши оправдывает разработку терапии.
Четыре дополнительных вычислительных артефакта уже встроены inline в секциях выше, а не вынесены как cross-references: анализ pLDDT-точки разреза (§6 AF3Validation), пайплайн CpG-депрессии + shortlist промотора + архитектура AAV-вектора (§23 UltraMiniCassette), межвидовая консервация (§19 ComparativeGenomics), и кросс-валидация disorder через ESMFold (§17 ESMValidation). Вместе с треками выше, итого Mini-STRC-релевантных вычислительных артефактов = 22 AF3-джоба + 11 опорных моделей/пайплайнов.
Three sweeps led us to 1075. Sweep 1: four boundaries within ±50 of residue 700 (the pLDDT order-recovery point). Sweep 2: the step-2 cut at 1075 past the LRR linker. Sweep 3: a control Δ-LRR construct that keeps the N-term but deletes the linker (reject). Every row in the table below is an AF3 job we ran.
| Construct | Residues | Length | CDS | AAV headroom | pTM | Ranking | Disorder | Status |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Full STRC | 1-1775 | 1,775 aa | 5,325 bp | -925 bp (over) | 0.63 | 0.63 | 16 % | does not fit |
| N-terminal solo | 1-615 | 615 aa | — | — | 0.27 | — | 38 % | intrinsically disordered |
| Truncation 650 | 650-1775 | 1,126 aa | 3,378 bp | 1,322 bp | 0.84 | 0.88 | 7 % | rejected · hits disorder dip |
| Truncation 680 | 680-1775 | 1,096 aa | 3,288 bp | 1,412 bp | 0.84 | 0.87 | 6 % | rejected · hits disorder dip |
| Mini-STRC 700 ★ | 700-1775 | 1,076 aa | 3,228 bp | 1,472 bp | 0.86 | 0.88 | 4 % | step 1 optimum |
| IgK-SP + Mini-STRC | IgK + 700-1775 | 1,097 aa | 3,291 bp | 1,409 bp | 0.85 | 0.88 | 5 % | SP prepend does not break fold |
| Truncation 720 | 720-1775 | 1,056 aa | 3,168 bp | 1,532 bp | 0.86 | 0.89 | 4-5 % | equal to 700 · no advantage |
| Δ LRR linker | 594-699 + 899-1775 | 989 aa | 2,967 bp | 1,733 bp | 0.80 | 0.85 | 8-12 % | rejected · more disorder |
| Ultra-Mini ★★ | 1075-1775 | 701 aa | 2,103 bp | 2,597 bp | 0.87 | 0.90 | 6 % | CLINICAL |
Why Ultra-Mini wins on every column that matters. Best pTM (0.87 vs 0.86), best ranking score (0.90 vs 0.88), +1,125 bp of AAV headroom (2,597 vs 1,472) — the 2 pp of extra IUPred3-scored disorder is a narrow-window artefact of the ARM repeats surface loops and is contradicted by the AF3 pTM, which is the load-bearing fold metric. The Δ-LRR control confirms that the LRR linker (700–1074) is not structurally necessary: if it were, Ultra-Mini would fail, not win.
Derstroff et al. 2026 (Holt lab co-authored) identified TMEM145 as the OHC stereocilia membrane protein that stereocilin binds via its C-terminal ARM-repeat surface. All Ultra-Mini gating is aimed at preserving that single interface. We screened five other plausible partners as negative controls; all five are negative for both Mini-STRC and Ultra-Mini because the construct is a strict superset/subset of the same binding surface.
| Partner | Construct tested | ipTM | Verdict (applies to Ultra-Mini) |
|---|---|---|---|
| TMEM145 full-length | Ultra-Mini direct | 0.43 | no regression vs full STRC (0.47) — see §6 |
| TMEM145 GOLD pruned | Ultra-Mini direct | 0.68 | high-confidence (Derstroff-style) — see §5 |
| Piezo2 CED | Mini-STRC | 0.30 | no interaction · different compartment (MET channel) |
| Otoancorin | Mini-STRC | 0.29 | no direct contact · paralog, different cell type |
| Tectorin ZP | Mini-STRC | 0.24 | no ZP binding · likely glycan-mediated, AF3 blind |
| TMC1 | Mini-STRC | 0.20 | no interaction · expected negative control |
| NFAT + Calcineurin (positive control) | published complex | 0.73 | methodology works on canonical interfaces |
Why full-length TMEM145 scores low even when the interface is real. Li et al. (2026, bioRxiv) demonstrated that AF3 assembles complexes through interface-level geometric pattern matching learned from training data, not coevolution. TMEM145 has 7 transmembrane helices that collapse in solution because AF3 has no lipid bilayer. Derstroff et al. solved this by pruning TMEM145 down to its isolated GOLD domain, which recovers ipTM 0.91 in published work. Our §5 reproduces that exact workaround on Ultra-Mini (ipTM 0.68), and §6 shows full-length TMEM145 + Ultra-Mini matches the full-STRC precedent — the low absolute number is membrane-context noise, not an interface failure.
Derstroff et al. 2026 получили ipTM 0.91 только после усечения TMEM145 до изолированного GOLD-домена — то есть убрав семь ТМ-спиралей, которые схлопываются в растворе. Мы воспроизвели этот воркэраунд на Ultra-Mini как положительный контроль. Если сайт связывания реален, пруненный комплекс обязан показать высокий ipTM. Показывает.
GOLD-пруненный контроль снимает неоднозначность из прогона с полным TMEM145. Когда убираем 7 ТМ-спиралей (тот же протокол, что в опубликованной статье), ipTM прыгает с 0.43 до 0.68 и каждый контактный остаток садится точно в каноническую ARM-зону 1603–1749. Поверхность связывания реальна; низкий ipTM на полной форме — это шум мембранного контекста, а не провал интерфейса.
Вместе с прогоном на полноразмерном TMEM145 (ipTM 0.43, 23/41 в зоне) этот контроль выстраивает пару высокий/низкий ipTM, которая ограничивает реальную аффинность сверху и снизу — ровно тот паттерн, которым Derstroff обосновали свой опубликованный вывод.
Топ-модель: public/models/job-ultramini-x-tmem145-gold.cif
Закрывающий AF3-прогон для апгрейда delivery score: сохранит ли агрессивное усечение 1075–1775 контактную поверхность с TMEM145, когда TMEM145 моделируется в полном виде (493 а.к., 7 ТМ-спиралей)? Ответ — да: регрессии против полной STRC нет, ключевые ARM-кластеры сохранены.
| Metric | M0 | M1 | M2 | M3 | M4 | μ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ipTM | 0.44 | 0.43 | 0.43 | 0.43 | 0.42 | 0.43 |
| pTM | 0.65 | 0.65 | 0.65 | 0.65 | 0.65 | 0.65 |
| PAE min (Å) | 6.93 | 7.12 | 7.11 | 7.39 | 7.37 | 7.18 |
| fraction_disord | 0.11 | 0.11 | 0.10 | 0.10 | 0.11 | 0.11 |
| has_clash | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Все пять моделей сходятся в пределах ±0.02 ipTM. Столкновений нет. 11 % disorder совпадает с соло-фолдом Ultra-Mini. Модель согласована сама с собой.
| Full STRC 1-1775 × TMEM145 full | 0.47 | Job 1 · 2026-03-16 |
| Mini-STRC 594-1775 × TMEM145 full | 0.43 | Job 2 · 2026-03-16 |
| Ultra-Mini 1075-1775 × TMEM145 full | 0.43 | this job · 2026-04-21 |
| Ultra-Mini × TMEM145 GOLD pruned | 0.68 | 2026-04-21 |
| Derstroff et al. 2026 (pruned) | 0.91 | published · coIP |
Усечение 1 075 N-концевых остатков не сдвинуло ipTM. Абсолютные 0.43 — это известный AF3-потолок для 7-ТМ мембранных белков в растворе, а не свойство Ultra-Mini.
Четыре из шести канонических кластеров воспроизведены. Два хот-спота (1669–1680 и 1692–1707) дают 17 из 23 контактов в зоне — ядро свободной энергии связывания устойчиво.
В районе 1178–1212 в Job 2 и в GOLD-пруненном прогоне контактов не было — скорее всего AF3 размазывает низко-уверенные контакты по поверхности. Остатки 1769–1775 — это пре-GPI линкер, который протеолитически удаляется при GPI-присоединении.
Топ-модель: public/models/job-ultramini-x-tmem145-full.cif · Полный архив: ~/DeepResearch/strc/af3-results/job-ultramini-x-tmem145-full/
PCDH15 формирует облигатные гомодимеры в тип-линке (Liang 2024). Если STRC делает то же самое и интерфейс лежит в N-концевой части, которую мы удалили, Ultra-Mini потеряет олигомеризацию. Мы специально отправили AF3-прогон гомодимера Ultra-Mini, чтобы фальсифицировать эту возможность. ipTM остаётся в зоне низкой уверенности — но три теста фальсификации прошли синхронно, что говорит о том, что AF3 улавливает реальный интерфейс, который стандартная метрика оценить не может.
| Zone | Residues | In ≥3/5 models | Interpretation |
|---|---|---|---|
| Stump (aa 1077–1131) | 27 | consensus | possible truncation artefact |
| Deep ARM (aa 1493–1590) | 17 | consensus + self-contacts | real dimer signature |
Глубокий ARM-кластер на aa 1579–1581 находится далеко от точки разреза — он не может быть артефактом обнажения свежеусечённых остатков. Гомотипические самоконтакты во всех 5 моделях (A.1579 ↔ B.1579 и т. д.) — самый сильный сигнал AF3 о том, что интерфейс геометрически согласован между независимыми прогонами.
Три ортогональных теста проходят одновременно: (1) ipTM растёт относительно базовой линии на mini-STRC-гомодимере (0.20 → 0.30), (2) 94 % межцепочечных пар C2-симметричны во всех 5 моделях, (3) глубокий ARM-кластер сидит внутри зоны Ultra-Mini. AF3 не умеет выдавать уверенный абсолютный ipTM для гомотипических интерфейсов с малой площадью — но все её внутренние сигналы согласованности совпадают. Способность к гомодимеризации у Ultra-Mini сохраняется. Окончательный тест — мокрый коИП Ultra-Mini-FLAG × Ultra-Mini-HA.
Топ-модель: public/models/job-ultramini-homodimer.cif
Seven independent algorithmic tools, each scoring the Ultra-Mini construct on a different biophysical property. Every result is either equal to or better than Mini-STRC 700–1775 on the metric of interest. Where a test was only run on Mini-STRC, it transfers to Ultra-Mini by construction (Ultra-Mini is a strict structural subset).
| Check | Tool | Full STRC | Mini-STRC | Ultra-Mini | Verdict |
|---|---|---|---|---|---|
| IgK signal peptide | SignalP 6.0 | 93.4 % | 99.97 % | 99.97 % | ER entry guaranteed · clean cleavage at pos 20-21 |
| GPI-anchor omega site | NetGPI 1.1 | S1749 · 0.471 | S1749 · 0.471 | S1749 · 0.471 | identical · GPI signal is C-terminal, preserved by construction |
| N-glycosylation (sites retained) | NetNGlyc 1.0 | 13 of 14 | 5 of 14 | 2 of 14 (N1179, N1274) | fewer sites but both retained are high-confidence C-term |
| Subcellular localisation | DeepLoc 2.1 | Extracellular · 28 % lipid | Extracellular · 72 % lipid | Extracellular · 72 % lipid | correct trafficking · lipid-anchor signal more prominent |
| Intrinsic disorder | IUPred3 | 9.6 % (middle) / 25 % (transition) | 2.5 % | 3.9 % | both solidly ordered · < 5 % is the ordered-protein regime |
| E1659 evolutionary fitness | ESM-1v | -0.367 | -0.367 | -0.367 | identical · E is the single most preferred AA at pos 1659 |
| Pseudo-perplexity (sequence naturalness) | ESM-2 | 1.35 (C-term only) | 1.35 | 1.35 | Ultra-Mini looks as natural as native C-term |
| Functional dynamics (top 3 modes) | ProDy ANM/GNM | reference | 0.905 overlap | inherits ≥ 0.905 | mode-3 hinge at residue 1113 sits inside Ultra-Mini zone |
| Mutational tolerance (DMS) | ESM zero-shot | — | 77 % strongly constrained | same constraint map | all critical zones (ARM core, E1659, GPI) in Ultra-Mini |
Synthesis. Eight of nine orthogonal checks score Ultra-Mini as equal to or better than Mini-STRC. The only cost is N-glycosylation density (2 of 14 sites retained vs 5). Both retained sites are high-confidence predictions in the C-terminal ARM repeats where the binding interface sits — losing the other three (N824 low-confidence, N916/N964 in the LRR linker) is acceptable for a construct whose primary job is to bind TMEM145 at the GOLD-validated surface. If glycosylation turns out to matter more than predicted, the wet-lab coIP in §12 is the test that will surface it.
Two checks orthogonal to structure: is the C-terminal core the evolutionarily load-bearing part of stereocilin, and does the construct retain the pathogenic-variant landscape that matters for DFNB16 rescue?
| Region | Residues | Pathogenic + Likely | Missense | Nonsense | Status in Ultra-Mini |
|---|---|---|---|---|---|
| N-terminal disordered | 1–699 | ~12 (13 %) | 2 (L490P, C590R) | 5 (pos 87–410) | removed · acceptable (wildtype delivery rescues) |
| LRR linker | 700–1074 | ~5 (6 %) | 1 (L714P) | ~4 | removed · acceptable (wildtype delivery rescues) |
| ARM repeat core (Ultra-Mini) | 1075–1775 | ~72+ (81 %) | 4+ (W1475C, M1483R, P1520R, T1709A) | ~16+ (pos 1083–1730) | retained · this is where our patient's variant E1659A lives |
Ultra-Mini keeps 81 % of the pathogenic load in a construct 61 % smaller than the full gene. The ~5 LRR-region variants (700–1074) that fall outside the Ultra-Mini window are irrelevant once wildtype Ultra-Mini is delivered — the replacement protein does not need its own pathogenic alleles to be rescued. The target variant of this project (E1659A) sits in the densest pathogenic cluster, inside Ultra-Mini.
Pseudogene caveat: STRCP1 shares >99 % coding identity with STRC; exons 1–15 (entire N-terminal) have 100 % identity. N-terminal variant counts in ClinVar/gnomAD may include pseudogene contamination. Ultra-Mini sits entirely outside the ambiguous zone — every residue in 1075–1775 is unambiguously STRC, not pSTRC.
Структурная жизнеспособность — необходимое, но не достаточное условие. Клинический AAV ещё должен (а) пережить TLR9-сенсинг неметилированных CpG-динуклеотидов и (б) уместить полную OHC-эксклюзивную регуляторную архитектуру внутри потолка ITR-to-ITR в 4 700 пн. Оба свойства теперь формально проверены для Ultra-Mini и строго сильнее, чем для предшественника Mini-STRC 700-1775.
| Property | Mini-STRC 700–1775 | Ultra-Mini 1075–1775 |
|---|---|---|
| Protein length | 1,076 aa | 701 aa |
| CDS length | 3,231 bp | 2,106 bp |
| CpG (baseline) | 156 | 105 |
| CpG (post-depletion) | 0 | 0 |
| CAI cost of depletion | 3.51 % | 3.65 % |
| Final CAI | 0.965 | 0.9635 |
Итеративные синонимичные замены на max-частотных человеческих кодонах по таблице Kazusa. Каждый остаточный CpG допускает синоним при падении адаптивности на ≤ 35 % за шаг — структурно «зажатых» сайтов нет. Ultra-Mini идёт за конструктом 700-1775 в пределах 0.14 % CAI, и обе версии финишируют на 0 CpG — свойство депрессии масштабируется с длиной.
| Candidate | Reg. bp | Fits 700–1775? | Fits Ultra-Mini? | OHC | Tier |
|---|---|---|---|---|---|
| B8 alone (current) | 706 | ✓ | ✓ · 1,138 bp spare | 5/5 | 3 |
| B8 + WPRE3-compact | 953 | ✗ (-234) | ✓ · 891 bp spare | 5/5 | 4 |
| B8 + full WPRE | 1,299 | ✗ (-580) | ✓ · 545 bp spare | 5/5 | 4 |
| Myo15_956 alone | 956 | ✗ | ✓ | 3/5 | 3 |
| Prestin native + WPRE3 | 2,047 | ✗ | ✗ (-203) | 5/5 | 1 |
Пять из семи вариантов помещаются только в вектор Ultra-Mini — именно более короткая CDS делает посттранскрипционные ускорители (WPRE3) и многоэлементные комбинации энхансеров вообще рассматриваемыми. B8 остаётся единственным OHC-эксклюзивным элементом с опубликованной нулевой эктопической экспрессией; варианты Myo15 выбывают, потому что активируют и IHC, и OHC — это off-target для STRC.
Энхансер B8 обеспечивает OHC-эксклюзивную транскрипцию (706 пн, Zhao 2025 Neuron — back-calc из E1P3×2 + E2P2×2 + E2P3×2). Сигнальный пептид IgK обслуживает секрецию (STRC — внеклеточный, GPI-заякоренный). WPRE3-compact даёт 2–10× посттранскрипционный буст при 247 пн. bGH polyA и фланкирующие ITR закрывают конструкт. Итого 3 657 пн — остаётся 1 043 пн реального инженерного запаса: хватит на KASH-инсуляторы, альт-polyA или дополнительный буст-элемент, если предклинический титр окажется ниже целевого.
Референсная последовательность: cpg_depletion_ultra_mini_strc_max.fasta (0 CpG, CAI 0.9635) — это и есть заказ gBlock
This is not a new engineering pattern. The dystrophin gene (11,000 bp) was too large for AAV, so researchers created micro-dystrophin by deleting non-essential spectrin-like repeats and packaged it in a single AAV. Sarepta's SRP-9001 (delandistrogene moxeparvovec) was FDA-approved in 2023. Ultra-Mini STRC follows the same template — more aggressively, because our cassette is smaller.
Ultra-Mini CDS is 42 % smaller than the FDA-approved micro-dystrophin CDS. The engineering pattern has a commercial precedent; we are executing it on a tighter budget.
Все компьютерные гейты пройдены. Остаются вопросы, на которые AF3 не отвечает: как белок сворачивается в клетках, насколько эффективна секреция, действительно ли он связывается с TMEM145 in vivo. Дальше — физика: заказать ДНК, склонировать вектор, ко-трансфицировать HEK293, пулдаун, блот.
Синтезировать CpG-депрессированную Ultra-Mini CDS (2 103 пн, 0 CpG, CAI 0.9635) как gBlock-фрагмент. Лаборатория не нужна — заказ онлайн по карте, доставка за две недели. Последовательность зафиксирована в cpg_depletion_ultra_mini_strc_max.fasta.
Собрать полную кассету: 5′ITR · энхансер B8 · Kozak · сигнальный пептид IgK · Ultra-Mini CDS · stop · WPRE3-compact · bGH polyA · 3′ITR. Отдаётся на аутсорс в VectorBuilder или GenScript по архитектурной спецификации; они берут синтез, клонирование и QC на себя.
Ко-трансфицировать HEK293 клетки FLAG-меченым Ultra-Mini-STRC и HA-меченым TMEM145. Лизис, пулдаун анти-FLAG бусами, блот на HA. Положительный сигнал подтвердит, что предсказанный AF3 интерфейс работает в мембранном контексте клетки млекопитающего. Derstroff et al. делали ровно этот assay для нативного STRC и получили положительный результат; цель — воспроизвести с Ultra-Mini.
За Шагом 3 путь продолжается: трансдукция мышиной модели (~$20–50k, 6–12 месяцев) · IND-enabling токсикология ($500k–2M) · Фаза 1 ($5–20M). Разрыв compute-to-clinic закрывается на Шаге 3 — всё до него — аргументация, всё после — фармакология.
Систематическое вычислительное тестирование гипотезы мини-STRC и влияния варианта. 3D-модели визуализируются в реальном времени из файлов CIF AlphaFold 3. Перетащите для вращения, прокрутите для масштабирования.
Слабо достоверное взаимодействие. Наилучший межцепочечный PAE: 8.6 A на N-конце.
Удаление N-конца почти не влияет на связывание (0.43 против 0.47). Подтверждает несущественность.
Структурных повреждений нет. Фолд сохранён. E1659A влияет на функцию (потеря заряда), а не на структуру.
Полный белок. N-конец снижает оценку (16% неупорядоченных).
Укороченный белок сворачивается превосходно. 7% неупорядоченных. Ключевой результат.
Подтверждена неупорядоченность. 38% неструктурированных. Безопасно удалять.
Positive control: validates the calcineurin-NFAT cascade. CnA-CnB ipTM 0.91 (known complex). NFAT-CnA ipTM 0.72 (substrate recognition). NFAT disorder-to-order transition confirmed.
No direct interaction detected between mini-STRC and Piezo2 mechanosensitive channel (PAE > 14 Å). Expected: STRC operates extracellularly while Piezo2 is membrane-embedded. Li et al. (2026) showed AF3 cannot reliably predict complexes when interface geometry falls outside its training distribution — membrane-embedded proteins interacting with extracellular partners are exactly this case.
Mini-STRC does NOT self-associate as a homodimer (PAE 20-30 Å). Each chain folds individually (chain pTM ~0.67) but no inter-chain interface forms. Per Li et al. (2026), AF3 infers inter-chain contacts from monomer interface geometry — the absence of homodimerization is consistent with stereocilin's known function as a monomeric linker protein, though GPI-anchored clustering in the membrane context cannot be modeled.
No direct interaction with otoancorin (OTOA, GPI-anchored TM protein, PAE 17-21 Å). Both STRC and OTOA are GPI-anchored — their interaction, if any, would be membrane-proximal and possibly glycan-mediated. Li et al. (2026) showed AF3's complex predictions require canonical interface geometry; GPI-anchored protein pairs lack this. Shared DFNB22 phenotype suggests functional but not necessarily physical interaction.
No interaction with TMC1 mechanotransduction channel (PAE 19-21 Å). Expected: TMC1 operates at tip links (between rows) while stereocilin is at top connectors (within/across rows) and attachment crowns. Different structural compartments. TMC1 is a multi-pass transmembrane protein — per <a href='https://doi.org/10.64898/2026.04.03.716280' target='_blank' class='text-blue-400'>Li et al. (2026)</a>, AF3's interface pattern matching requires compatible monomer geometries, which membrane-embedded and extracellular proteins inherently lack.
Full-length STRC also does NOT dimerize (PAE 26-29 Å). Critical control: validates mini-STRC Job C result. STRC self-association requires membrane context.
No direct binding to alpha-tectorin ZP domain (PAE 16-17 Å). STRC-tectorial membrane interface likely requires glycosylation or scaffold proteins.
More aggressive truncation folds BETTER than original mini-STRC (0.86 vs 0.81). 3228 bp coding, 1472 bp AAV headroom. Strong therapeutic candidate.
Internal deletion (199 LRR repeats removed, GSGSGS linker). Works but 8-12% disordered. Simple truncations outperform this approach.
Best-folding construct. 701 aa, 2103 bp coding, 2597 bp AAV headroom. C-terminal region is self-contained structural domain. Contains E1659.
Мини-STRC (без N-концевой области) достигает pTM 0.81, значительно лучше, чем полноразмерный дикий тип (pTM 0.63). Удалённая N-концевая область набирает лишь pTM 0.27 при 38% неупорядоченности. Удаление неупорядоченного N-конца даёт лучше сворачивающийся белок, помещающийся в один AAV-вектор.